熒光顯微鏡的原理與應(yīng)用

一、熒光顯微鏡的原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。這樣在強(qiáng)烈的對(duì)襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源 、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。

（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長(zhǎng)的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長(zhǎng) ，所以需加用激發(fā)濾片(一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片)，僅使一定波長(zhǎng)的激發(fā)光透過(guò)照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見(jiàn)熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過(guò)，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。

熒光顯微鏡就其光路來(lái)分有兩種：

1.透射式熒光顯微鏡: 激發(fā)光源是通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上.這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱.所以對(duì)觀察較大的標(biāo)本材料較好。

2.落射式熒光顯微鏡這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45。角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開(kāi)，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。

二、熒光顯微鏡使用方法

1.打開(kāi)燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。

2.透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的插塊。

3.用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。

4.放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。 使用中應(yīng)注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷;用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須用無(wú)熒光的特殊油鏡;高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開(kāi)，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。

三、觀察

在示教臺(tái)上的熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光片，可見(jiàn)經(jīng)o.01%的丫啶橙熒光染料染色的細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。