熒光顯微鏡原理圖，激發(fā)濾板和壓制濾色系統(tǒng)
熒光顯微鏡是以紫外線(xiàn)為光源， 用以照射被檢物體， 使之發(fā)出熒光， 然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。 細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線(xiàn)照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線(xiàn)照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對(duì)這類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。
（熒光顯微鏡原理圖）
濾色系統(tǒng)
濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號(hào)，各廠(chǎng)家名稱(chēng)常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號(hào)特點(diǎn)。如德國(guó)產(chǎn)品(Schott)BG12，就是種藍(lán)色玻璃，B是藍(lán)色的第一個(gè)字母，G是玻璃的第一個(gè)字母;我國(guó)產(chǎn)品的名稱(chēng)已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾板名為QB24，Q是青色(藍(lán)色)拼音的第一個(gè)字母，B是玻璃拼音的第一個(gè)字母。不過(guò)有的濾板也可以透光分界濾長(zhǎng)命名，如K530，就是表示壓制濾長(zhǎng) 530nm以下的光而透過(guò)530nm以上的光。還有的廠(chǎng)家的濾板完全以數(shù)字命名，如美國(guó)Corning廠(chǎng)的NO：5-58，即相當(dāng)于BG12。
1.激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類(lèi)激發(fā)濾板，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過(guò)，阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)。常用型號(hào)為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過(guò)。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過(guò)。常用型號(hào)為QB24(BG12)。
最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達(dá)明色素)可用藍(lán)綠濾板(如B-7)激發(fā)。
開(kāi)始采用金屬膜干涉濾板，由于針對(duì)性強(qiáng)，波長(zhǎng)適當(dāng)，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠(chǎng)的FITC專(zhuān)用KP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板，均遠(yuǎn)比玻璃濾板效果好。
激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些?；疽笫且垣@得最明亮的熒光和最好的背景為準(zhǔn)。
2.壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過(guò)，提供相應(yīng)波長(zhǎng)范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對(duì)應(yīng)，常用以下3種壓制濾板：
紫外光壓制濾板：可通過(guò)可見(jiàn)光、阻擋紫外光通過(guò)。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍(lán)光壓制濾板：能通過(guò)510nm以上波長(zhǎng)的光(綠到紅)，能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾板：能通過(guò)460nm以上波長(zhǎng)的光(藍(lán)到紅)，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490，K510。
反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因?yàn)殇X對(duì)紫外光和可見(jiàn)光的藍(lán)紫區(qū)吸收少，反射達(dá)90%以上，而銀的反射只有70%;一般使用平面反光鏡。
聚光鏡
專(zhuān)為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。
1.明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強(qiáng)，使用方便，特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。
2.暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時(shí)，可用無(wú)色濾板(不透過(guò)紫外)而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。
3.相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。
物鏡
各種物鏡均可應(yīng)用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能(波長(zhǎng)范圍)適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時(shí)其影響非常明顯。因此對(duì)熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡(4×,5×，6.3×等)。
目鏡
在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過(guò)去多用單筒目鏡，因?yàn)槠淞炼缺入p筒目鏡高一倍以上，但研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。
落射光裝置
新型的落射光裝置是從光源來(lái)的光射到干涉分光濾鏡后，波長(zhǎng)短的部分(紫外和紫藍(lán))由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當(dāng)濾鏡對(duì)向光源呈45。傾斜時(shí)，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標(biāo)本，使標(biāo)本受到激發(fā)，這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用。同時(shí)，濾長(zhǎng)長(zhǎng)的部分(綠、黃、紅等)，對(duì)濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標(biāo)本的熒光處在可見(jiàn)光長(zhǎng)波區(qū)，可透過(guò)濾鏡而到達(dá)目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高，在高放大時(shí)比透射光源強(qiáng)。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標(biāo)本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱(chēng)之為落射熒光顯微鏡。